无细胞蛋白表达筛选系统应用案例：难表达蛋白转录因子L的制备与筛选

一、转录因子研究的制备难点

转录因子是细胞通路的核心调控蛋白，参与细胞发育、分化等生理过程。其中，转录因子L（TFL）参与多项组织发育，其表达异常与部分发育障碍相关，是相关领域的重要研究靶点。
但TFL的制备存在诸多困难：该蛋白包含LIM结构域、同源结构域及内在无序区域，在大肠杆菌体系中表达易形成不溶性包涵体，复性难度大，功能性蛋白获取量少；在昆虫细胞、哺乳动物细胞、酵母等其他体系中，也存在获取量不足、纯化繁琐、蛋白易降解等问题，阻碍了TFL的结构解析、功能研究及靶向研究推进。
针对这一行业痛点，nuclera推出的eProtein Discovery无细胞蛋白表达筛选系统展现出独特优势。曼博生物代理eProtein Discovery无细胞蛋白表达筛选系统，如有需要欢迎点击了解无细胞蛋白表达系统详情。
研究人员借助该系统，成功完成全长TFL及两个功能结构域的无细胞蛋白表达与纯化，通过优化蛋白可溶性功能筛选条件，验证了制备蛋白的DNA结合功能。这一实践不仅为这类复杂难表达蛋白研究提供了可参考的技术方案，也充分体现了无细胞蛋白合成技术的应用价值，下面将详细解析该系统的核心技术与工作流程。

二、eProtein Discovery系统的核心技术与工作流程

eProtein Discovery是nuclera推出的无细胞蛋白合成系统，又称体外转录/翻译系统，其核心优势在于摆脱对活体细胞培养的依赖，实现蛋白制备的自动化。该系统依托cell-free system，结合数字微流控蛋白筛选、纳升液滴蛋白表达等关键技术，实现无细胞蛋白表达自动化，为难表达蛋白快速获取提供技术保障。
具体而言，该系统可同时筛选24种可溶性蛋白或11种膜蛋白，每种蛋白搭配8组不同表达条件，48小时内即可完成从DNA到活性蛋白的制备与纯化，其筛选结果还能为体内表达体系的菌株选择、质粒设计提供参考，顺畅衔接后续蛋白纯化表达流程。其核心工作流程分为三个关键阶段，全程自动化操作，可有效缩短蛋白制备周期，具体如下：

1、筛选条件优化：

将设计好的eGene构建体、定制化无细胞混合体系加载至数字微流控卡盒，系统24小时内可完成192组表达条件筛选，生成192组表达数据和30组纯化数据，自动分析并筛选出适配的表达组合，确定蛋白放大生产的适配条件；

2、蛋白放大制备：

根据筛选结果，选取对应表达组合进行过夜放大培养，借助专用纯化试剂完成蛋白纯化，从而获得微克级目标蛋白，可通过SDS-PAGE、Western blot等实验验证蛋白表达与纯化效果；

3、蛋白功能验证：

将制备好的蛋白用于后续功能实验，验证其生物学功能，完成从蛋白制备到功能研究的闭环，为后续科研提供直接支撑

三、TFL的无细胞蛋白制备与筛选方案

基于上篇解析的eProtein Discovery无细胞系统核心技术与工作流程，研究人员针对TF L这类高度无序的难表达转录因子，开展了专项无细胞蛋白表达与纯化研究，逐步形成了完整的难表达蛋白快速获取方案。该方案全程严格遵循无细胞蛋白合成逻辑，优化每一步实验条件，确保实验结果的可靠性，具体方案如下：

1、构建体设计与制备：

选取全长TF L、未知功能结构域L2、DNA结合结构域L3三种蛋白变体，通过系统内置的AlphaFold结构预测工具设计L2、L3，将三种变体导入系统云软件优化密码子后，添加3C和TEV序列；利用可溶性标签筛选技术，构建24个含不同可溶性标签的eGene构建体及1个无标签对照构建体，所有构建体C端均整合Strep标签和检测标签，分别用于磁珠纯化和蛋白定量。

2、无细胞混合体系配置：

选取8种无细胞混合体系，在核心翻译机制基础上，添加金属辅因子、分子伴侣、二硫键促进剂及3C蛋白酶；结合TF L含两个LIM结构域的特点，在体系中加入Zn²⁺，稳定蛋白锌结合区域，为蛋白正确折叠提供适配环境。

3、自动化筛选与分析：

将24个eGene构建体、8种无细胞混合体系及纯化磁珠、对照样品、缓冲液等加载至微流控卡盒，系统自动生成并分析192组表达图谱，24小时内筛选出每种蛋白变体对应的10组高表达组合并完成纯化，确定各变体的放大生产预测得率，为后续放大制备提供数据支撑。

四、TFL制备结果与功能验证

按照上述制备与筛选方案，研究人员依托eProtein Discovery系统，成功完成了三种TF L变体的制备与纯化。通过系统分析筛选数据、蛋白制备结果及功能验证实验，不仅验证了该系统在难表达蛋白制备中的应用效果，也为无细胞蛋白合成技术在转录因子研究中的多种应用提供了坚实的实验依据，具体结果如下：
筛选数据揭示优化方向：系统筛选的30组高得率表达条件中，所有构建体均含可溶性标签，全长TF L和L2适配P17标签，L3适配CUSF标签，与无标签构建体相比，蛋白表达量有所提升，体现了可溶性标签在蛋白可溶性功能筛选中的作用；无细胞混合体系中，Zn²⁺可稳定蛋白结构，GSSG、PDI⁺/GSSG的氧化环境配置，可提升不同蛋白变体的表达量，为复杂蛋白无细胞表达条件优化提供参考

图1：TFL变体的AlphaFold结构预测。图示为全长TF L的预测结构（重点关注区域已高亮标注）。蛋白变体L2和L3基于上述区域筛选设计，同时获得了这些截短蛋白的结构预测结果。

图2：eGene构建体与无细胞混合体系的筛选。(A) 含可溶性标签的TF L eGene构建体设计方案。(B) 用于提高可溶性蛋白得率的无细胞混合体系筛选结果。

放大制备获得高纯度蛋白：选取适配表达组合进行过夜放大培养，在1.5mL体系中成功获得微克级三种TF L变体蛋白；SDS-PAGE分析显示，纯化后蛋白出现与预期分子量一致的单一条带，Western blot实验验证了蛋白标签的完整性，证实蛋白成功表达与纯化，可满足后续功能实验需求。
功能验证证实蛋白活性：通过DNA结合电泳迁移率变动分析验证蛋白生物学功能，结果显示，全长TF L可与含结合位点的标记DNA发生浓度依赖性结合，L3结构域可与DNA探针形成特异性复合物，阴性对照无结合现象；L2结构域未表现出DNA结合能力，为其功能研究提供了新线索，也证实eProtein Discovery系统制备的蛋白保留天然生物学功能。

三、无细胞蛋白表达技术的应用价值

结合本次TF L的制备与验证实验，eProtein Discovery系统凭借无细胞蛋白合成的独特技术特点，成功解决了TF L这类高度无序转录因子的制备难题，48小时内即可完成从DNA到功能性蛋白的全流程制备，有效突破了传统表达体系在复杂蛋白制备中的技术限制，为难表达蛋白研究提供了全新的技术路径。
除了转录因子制备，该系统还整合数字微流控、无细胞蛋白表达、荧光蛋白定量检测等技术，实现表达条件的高通量筛选与准确优化，可完成可溶性蛋白快速制备，其筛选结果可与体内表达体系衔接，可进行规模化制备。
在AI蛋白工程、de novo蛋白设计等前沿科研领域，eProtein Discovery系统可发挥难表达蛋白快速获取的优势，为人工设计蛋白、新型功能蛋白的制备与验证提供支撑，助力科研人员开展蛋白结构研究、靶向药物研发、再生医学等探索，推动无细胞蛋白表达技术在更多科研场景落地。上海曼博生物作为正式的nuclera中国代理，为国内科研人员、生物医药企业提供eProtein Discovery系统的产品咨询、采购安装、技术支持等全流程服务，如您需要可点击了解曼博生物代理的蛋白表达系统。