无细胞蛋白表达技术解析：如何实现2天制备活性膜蛋白？

本文摘要：无细胞蛋白表达筛选系统依托无细胞蛋白合成技术快速制备活性膜蛋白，解决传统蛋白提取痛点。

传统的膜蛋白研究有哪些痛点？

在结构生物学与药物研发领域，膜蛋白是重要生理功能载体和核心药物靶点，超60%的FDA批准药物以膜蛋白为靶点，因此快速实现膜蛋白表达与膜蛋白纯化对药物研发十分关键。但其传统制备方法依赖去垢剂从细胞膜提取，易导致膜蛋白稳定性下降、错误折叠或活性丧失，为后续研究带来较大阻碍，也成为难表达蛋白快速获取的核心难题。

无细胞蛋白表达技术如何制备膜蛋白？

无细胞系统（cell free system）结合无细胞蛋白合成与数字微流控自动化技术，实现无细胞蛋白表达自动化，依托纳升液滴蛋白表达技术可快速完成膜蛋白筛选与制备，核心三步流程简单易操作：

1. 设计制备：将目标膜蛋白DNA序列输入配套软件，设计并制备对应的表达载体；
2. 自动筛选：系统通过数字微流控芯片，同步测试多组表达环境，评估膜蛋白可溶性产量,可同时自动筛选多达88种膜蛋白表达条件，24小时内完成11种DNA构建体和8组表达条件的筛选；
3. 放大生产：根据筛选数据确定适宜条件，直接放大生产，获得可用于下游分析的膜蛋白。

图1：无细胞蛋白合成系统膜蛋白生产工作流程。

该系统与传统技术不同，基于无细胞蛋白表达合成技术无需去垢剂膜提取，可直接优化纳米盘为膜蛋白提供类天然脂质环境，维持其结构稳定与生物活性，这也是实现难表达蛋白快速获取的关键所在。

膜蛋白实验：验证GPCR活性与结构

以原核生物ABC转运蛋白MsbA（典型难表达膜蛋白，因特殊结构易低产、错误折叠）为例，系统可同时测试不同纳米盘组成、去垢剂及氧化还原条件，准确快速筛选适配表达方案。

相关实验数据证实，该系统制备膜蛋白的效果明显优于传统方法：

对比传统去垢剂Brij-35，采用MSP1D1 dH5-DMPG特定纳米盘组合，能提升MsbA的表达产量；优化条件下放大生产后，可获得浓度约120 μg/mL的纯化MsbA，浓缩后浓度达1.8 mg/mL且无明显聚集。

图2：MsbA的放大培养与浓缩。(A) 优化纳米盘条件下纯化的MsbA产量，与卡盒预测产量（蓝色）的对比。(B)未浓缩MsbA的SDS-PAGE分析。

ATP酶活性测定显示，制备的MsbA具备预期酶活性，底物脂质A可刺激活性、抑制剂钒酸盐能抑制活性，证实蛋白功能完整；冷冻电镜分析进一步表明，纳米盘环境中制备的MsbA折叠构象正确、呈二聚化状态，与已发表的ABC转运蛋白结构特征一致。

该系统无需依赖去垢剂提取，可在两天内制备出活性与结构均完整的膜蛋白，有效解决了传统流程中去垢剂导致的蛋白不稳定性问题，为膜蛋白的结构与功能研究提供了全新途径。

本文基于nuclera公开资料由其中国供应商上海曼博生物整理，并提供高通量蛋白表达筛选及膜蛋白筛选制备技术支持，助力国内膜蛋白相关研究快速开展。本文仅用于科研信息分享。